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本制品是百奥莱博最新研发的Western Blot检测试剂盒，能够在1小时左右得到高质量的Western Blot结果，且操作简便、检测灵敏度高、背景低、不需再加入二抗、系统稳定性强。常规的Western Blot间接法检测过程(封闭、一抗结合和二抗结合)需要较长的时间，实验流程复杂且需要多步条件优化。胶上的蛋白转移到载体膜上后，使用试剂盒中的封闭液孵育5min，再用抗体反应液处理后的一抗孵育载体膜，经洗涤三次(每次5min)后，即可进行发光或显色检测。本试剂盒针对目的蛋白一抗为兔来源的实验系统使用。

• 客户需自己准备兔来源的一抗。
  
• 使用Blocking Buffer封闭液、Antibody Pretreat Solution（HRP/Rabbit）抗体反应液（兔）、Wash Buffer（10×）漂洗液之前请充分混匀。
  
• 漂洗液如在2～8℃保存时出现沉淀，请恢复到室温，把沉淀溶解后正常使用，1×漂洗液可在室温保存一个月。
  
• 建议转膜完成后用丽春红等试剂染色，并把膜上多余部分剪去以增加试剂的使用效率。
  
• 一抗和抗体反应液HRP（兔）需要通过预实验来确定最佳的稀释用量。
  
• 抗体反应液HRP（兔）、抗体稀释液和抗体用量可根据膜的大小按比例放大或减少。
  
• 加入一抗的抗体稀释液可以回收重复使用一次。特异性及亲和力低的抗体不建议重复使用。回收后抗体如在1～2天内使用放置在2～8℃，长期保存请在-20℃冻存，避免多次反复冻融。
  
• 如果存在较高背景的情况，请调整抗体的用量，并增加洗膜次数。
  
• 试剂盒内所有试剂请于2～8℃保存，避免冻融。

• 漂洗液准备：取10mL Wash Buffer（10×）用蒸馏水稀释至100mL，即为1×Wash Buffer，待用。每次洗膜用8～10mL。
  
• 封闭：转膜完成后，将膜浸没到10mL Blocking Buffer中，室温封闭5分钟。
  
• 漂洗：倒掉封闭液，加入8～10mL 1×Wash Buffer，于摇床上用较大速度漂洗1分钟。
  
• 洗膜的同时可准备抗体孵育液：取Antibody Pretreat Solution（HRP/Rabbit）100μL到离心管中，加入兔源一抗3～10μg，枪头吸打至充分混匀，室温孵育5分钟。加入至10mL Dilution Buffer中，充分混匀。
  注意：
  
  • 一抗的用量也可根据抗体的稀释度来进行调整。以抗体的最终稀释度1:1000为例，取100μL抗体反应液HRP（兔）到EP管中，加入10μL一抗，加入到10mL抗体稀释液中，充分混匀，室温孵育5分钟。
    
  • 如果膜面积较小，可按比例减少抗体、反应液及稀释液的用量。
• 完成步骤3后，倒掉漂洗液，将一抗、Antibody Pretreat Solution（HRP/Rabbit）及Dilution Buffer混合而成的抗体孵育液加到膜上（确保孵育液完全浸没膜表面），在摇床上以60rpm左右的速度室温孵育40分钟。
  
• 弃去（回收）抗体孵育液，用配制的1×Wash Buffer漂洗3～5次，每次3分钟。
  
• 进行后续检测。建议采用ECL或者DAB法进行检测。